​癌症基因组学：用于读取和写入 DNA 的简化工作流程

Iris
2022-03-12

癌症是由导致细胞生长失控的 DNA 改变引起的。其中一些改变对应遗传或种系突变，大多数对应获得性或散发性突变。致癌的 DNA 改变包括单核苷酸变异 (SNV)、拷贝数变异 (CNV)、插入/缺失 (INDEL) 和重排。

图片来源：Mohammed Haneefa Nizamudeen / Getty Images

当这些 DNA 改变被确定后，它们可以被作为生物标志物和药物靶点加以利用。它们还可以被用来实现肿瘤患者的精治疗。也就是说，测定一个特定患者的 DNA 改变或许可以为靶向治疗指明方向。

不幸的是，我们对致癌 DNA 改变的了解远非全面。但由于癌症基因组图谱（TCGA）等项目，这种情况正在逐步改善。

癌症基因组图谱项目由美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所共同主持开展，于 2018 年完成。它分析了代表 33 种癌症的 2 万个肿瘤，并产生了超过 2.5 PB 的基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组数据。所有这些数据现在都向研究界公开提供。

许多当前的努力反映了使用基因组技术来推进诊断测试和转化研究应用的兴趣。这些技术正在推进致病变异的发现、患者的筛查和分层以及新药的开发。


肺癌的综合 NGS 工作流程


安捷伦科技的现场应用科学家经理 Brigette Brown-Kipphut 对安捷伦公司肺癌样本的案例研究进行了介绍。她指出，该案例研究依赖于安捷伦开发的下一代测序 (NGS) 工作流程，该工作流程适用于从肿瘤活检中提取核酸。

Brown-Kipphut 表示，免疫组化分析显示，该样本在至少 50% 的肿瘤细胞中具有 PD-L1 表达，并且荧光原位杂交对 ALK/EML4 重排和 ROS1 融合呈阴性。该癌症最终被鉴定为非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）。

安捷伦科技开发了 Alissa Interpret 来帮助临床遗传学和分子病理学实验室有效地分类、管理和报告基因组变异。该图显示了 Alissa Interpret 提供的工具和功能如何实现跨不同应用领域和基因组事件的临床相关变异评估。

Brown-Kipphut 表示，人们可以测试进一步的突变，如重排和 CNV，但这样做费时又费力，而且不能保证会出现有用的结果。因此，Brown-Kipphut 提出了一个替代方案：人们可以使用 NGS 来简化这一过程，并产生高度全面的肿瘤基因组信息。

要采取这种替代方法，可以使用安捷伦的 SureSelect Cancer All-in-One Lung Assay，这是一种有针对性的 NGS 测试，可以分析与 NSCLC 相关的 20 个基因的肺癌 panel 。

Brown-Kipphut 强调说，该测试将所有变异类型的检测整合到一个工作流程中。测序完成后，变异被调用并在科学文献和公共癌症基因组数据库的背景下进行分析，最后生成一份报告。

在 Brown-Kipphut 描述的分析中，发现样本在 2 号和 13 号染色体之间有 ALK/MYO16 重排和 ERBB2 扩增。她认为，这些结果表明，NGS 技术可以显著缩短从样本提交到得出结果的成本和周转时间。

Brown-Kipphut 断言，根据 NGS 取代的测试数量，通常需要 1 到 4 周的分析可以缩短到 3 到 5 天。“由于肺癌肿瘤通常是异质性的，变异的频率可能很低，”她补充说。“在该测试中使用分子条形码可以检测那些以前由于背景噪声或 PCR/测序错误而无法识别的变异。”


更深入的基因组分析


SOPhIA Genetics 的产品总监 Emily Paul 博士对实体瘤检测进行了“深入研究”。她概述了公司的 SOPhIA Genetics 平台如何将基于 NGS 的测试范围扩展到检测 SNV 和 INDEL 等变异之外。DDM 还评估免疫肿瘤学生物标志物，例如微卫星不稳定性 (MSI)--这是缺失错配修复系统的分子指纹。

SOPHiA 宣称，其基于 DMS的解决方案之一，即实体瘤解决方案(STS)，在与 PCR 黄金标准对标时，能达到 100% 的分析灵敏度和特异性。该解决方案的算法已经过扩展，以适应综合测试的结果，吸收更多的 NGS 数据点来评估稳定性，并评估各种肿瘤类型。

SOPHiA Genetics 公司的 DDM 工作流程

SOPHiA Genetics 提供 DDM ，这是一个基于云的软件即服务平台，能够分析数据并从复杂的多模式数据集和不同的诊断模式中产生洞察力。该平台可以与试剂盒捆绑，以支持一系列应用和简化的端到端工作流程。

SOPHiA 的 DDM 平台还有助于在综合基因组分析中确定肿瘤突变负荷 (TMB) 评分，即确定肿瘤基因组每个编码区域的突变总数。TMB 很重要，因为它可以作为人体免疫系统如何对肿瘤本身作出反应以及免疫肿瘤学领域越来越多的治疗方法的指标。

“小型多基因 panel 测试至关重要，” Paul 坚持说。“它们很重要，因为它们帮助我们了解热点突变。但是如果我们只做小型 panel，我们将错过数百个其他可以指导治疗成功/有效性的靶点。”

Paul 指出，该公司已经开发出的技术不仅可以测试少数几个基因，它还可以在一个全面的基因组分析测试中同时测试 500 多个基因。

Paul 补充说，在临床方面，SOPHiA 正在向精准医疗领域发展。“我们正在进行一项临床研究，旨在对 IV 期 NSCLC 的影像数据、基因组数据和治疗数据的汇合进行回顾性分析，”她详细说明。“通过将我们的机器学习算法应用于这些数据集，我们可以根据无进展生存期对患者进行分层，这（或许）可以为治疗决策提供信息。”


个性化癌症基因组学分析


循环肿瘤 DNA (ctDNA) 是探测癌症基因组的另一种方法。它可用于监测治疗期间的癌症状态或检测治疗后的癌症复发。

Natera 生物制药业务发展全球副总裁 John Simmons 博士和肿瘤学医学总监 Angel Rodriguez 博士描述了 Natera 的平台 Signatera，以及它如何实现个性化、基于肿瘤的 ctDNA 测试，以实现微小残留病灶评估和复发监测。

Simmons 表示，该测试首先从肿瘤组织和匹配的正常全血中提取、进行全外显子组测序、分析和过滤基因组 DNA 。这个过程能识别患者特异性体细胞突变。本质上，它产生了 Natera 所谓的“肿瘤条形码”。

Signatera 可以在整个护理过程中为治疗决策提供信息。

Signatera 是由 Natera 开发的一种 ctDNA 测试，旨在用于对先前被诊断患有癌症的患者进行治疗监测和微小残留病灶评估。

Signatera   可以为患者提供个性化的血液测试，以适应在该个体肿瘤中发现的克隆突变的独特特征：算法会对患者血液中可用于多重 PCR 分析的肿瘤突变进行跟踪并对患者的血液样本进行处理以进行多重 PCR 扩增和超深度测序，以检测 ctDNA 的存在。

Rodriquez 指出：“在绝大多数实体瘤中，血液中的 DNA 分子片段水平极低。用以前的技术，它确实无法被检测到。Natera 正在创建每个患者的癌症特有的多个突变的分子条形码，它使我们能够在比过去低得多的水平上检测疾病的发生发展。”

Natera 对来自许多不同癌症类型（包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌）的患者的血液样本进行了验证，结果证实 Signatera 对复发性癌症的检测准确率达到了 90%~95% 。

Natera 正在与 Genentech 以及其他制药公司合作，在单独的临床试验中验证 Signatera 在检测已完成癌症治疗的患者的微小残留病灶方面的能力。


书写癌症研究的未来


Twist Bioscience 将癌症基因组研究带入了另一个方向：用其 DNA 书写技术从头开始设计定制的治疗性抗体来瞄准功能失常的蛋白质。

Twist Bioscience 的首席执行官 Emily Leproust 博士表示，该技术的核心是一个与标准 96 孔板大小相同的硅芯片。但芯片上没有 96 个孔，而是印有 100 万个 DNA 序列，就像一排排的小乐高塔。从本质上讲，它是一个基于硅的 DNA 合成平台。

Twist 利用其平台制造不同类型的产品。例如，在制造抗体时，Twist 利用该平台合成抗体编码的 DNA 序列（更具体地说，是与抗原结合区域相对应的序列）。这些序列被纳入产生抗体文库的基因-蛋白质的工作流程中。

这些文库使 Twist 可以针对感兴趣的目标筛选 100 亿种不同的抗体。该公司从第一轮筛选中就获得了最好的结果，并引入了 1 到 10 个突变，以创建第二轮的一百万个 DNA 序列。“通常情况下，我们最终得到的是一种非常强大的抗体，”Leproust 断言。“这是一种结合得非常好并且功能强大的抗体。”

Twist Biosciences 的 Twist 抗体优化(TAO)平台能产生高多样性、高质量的分子。该平台利用生物信息学和专利软件创建了一个带有天然人类重链和轻链 CDR 序列的优化库。

目前，Twist 在向制药业合作伙伴提供高亲和力、高功能、全人类的候选治疗性抗体方面已经取得了几十项成果。Twist 合作的癌症目标包括 A2A、CD3、PD1、TIGIT 和 CXCR4，另外还有两个未被披露的、可以申请许可的癌症靶点。


加快变异检测


由于隔夜杂交反应的性能增益，通过杂交捕获检测体细胞变异通常需要一天半的总周转时间。为了支持单日工作流程，罗氏开发了 KAPA HyperPETE 的试剂和试剂盒产品系列。

KAPA HyperPETE 产品可用于检测所有主要的体细胞变异类别，包括 SNVs、CNVs、短INDELs、MSI 状态和融合转录本（包括未知融合组合）。单日工作流程可将混合捕获的优越性能与一直以来只有扩增子工作流程才能实现的速度和简单性相结合。

罗氏开发了 KAPA HyperPETE (Primer Extension Target Enrichment)，用于特异性捕获和释放目标库分子进行测序。它能与各种样品类型兼容。热变性后，引物（绿色）被退火和延伸，链霉蛋白珠（紫色）被用来捕获杂交分子。特定目标的释放引物（红色）经过杂交和延伸，将目标分子从珠子中释放到上清液中。释放的产物用通用引物（蓝色）扩增。最终的文库被纯化、量化、汇集，并准备进行测序。

为了说明工作流程的实用性，罗氏试剂开发部主任 Brian Godwin 介绍了 KAPA HyperPETE 体细胞肿瘤 panel 的初步数据。例如，他表示，KAPA HyperPETE 泛癌小 panel 被用于体细胞 DNA 工作流程中。该测试在所有参考细胞系 DNA 样本中能检测到 100% 的等位基因频率为 1% 的短变体。

该工作流程的一个关键是利用目标特异性生物素化引物与 DNA 聚合酶的延伸复合物迅速推动反应向下进行，这一步骤需要 30 分钟。由此产生的引物延伸复合物被捕获到链霉蛋白珠上，而脱靶文库分子则会被洗脱。然后第二个目标特异性引物延伸步骤将分子从珠子上释放出来，并被收集和进行测序。

“我们从捕获引物延伸中获得特异性，”Godwin 断言。“但我们也知道，增加第二个释放引物的扩展会带来更多的特异性，因此可以对真正感兴趣的目标进行测序。”


临床开发
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