快讯|思勤医疗癌症早筛方法学文章登上美国分子病理学会官方期刊JMD
早筛网讯：近日，一篇题为“Non-invasive detection of hepatocellular carcinoma with circulating tumor DNA features and AFP”的研究论文发表于美国分子病理学会（Association for Molecular Pathology）官方期刊The Journal of Molecular Diagnostic（文章链接请点击文末阅读原文）。
该研究是思勤医疗携手北京大学深圳医院肝胆外科的专家团队进行的一项基于血浆游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）低深度全基因组测序（shallow whole genome sequencing, sWGS）结合AFP用于肝细胞癌早筛的合作研究。
The Journal of Molecular Diagnostics文章发表截图
◆ 共一作者：孟作为（北京大学深圳医院）、任庆旗博士（北京大学深圳医院）、钟果林（思勤医疗）、李世勇（思勤医疗）、陈彦博士（思勤医疗）；
◆ 共同通讯作者：茅矛博士（思勤医疗）、张锋博士（思勤医疗）。
目前行业内很多基于液体活检的癌症早筛技术多为基于癌症驱动基因来设计靶向panel检测点突变。一方面，为了提高检测下限，对目标基因位点区域的测序深度要达到4-5万次（40000-50000X）；另一方面，为了控制成本，所检测的基因区域较窄。相比之下，思勤医疗所采用的cfDNA sWGS检测方法可覆盖全基因组30亿对碱基，并通过公司自主发明的信息熵降噪（已获授权发明专利号：201980013999.4）的黑科技加持，使其测序量在靶向panel检测方法的十分之一的前提下，仍然能够准确生动地绘制癌症基因组全景地貌。
“癌症基因组全景地貌”示意图
该技术在基因组全景成千上万的有效数据点中，巧妙地选取了两个癌症特异性地貌特征 - 基因拷贝数畸变（copy number aberration, CNA）和片段大小（fragment size, FS），同时，结合肝癌特异性肿瘤标志物AFP，通过机器学习构建多组学多维度算法模型HCCseek，用于计算受检者罹患肝癌概率值PHCC。该检测方法使检测成本更加可控的前提下，其灵敏度为75.0%，特异度为98.0%，准确度为92.6%，AUC为0.954，在I期HCC的灵敏度为58.6%，各项指标均能达到国际顶尖水平。值得一提的是，HCCseek不仅能预测受检者患癌风险，还能提示患者疾病严重程度（包括肿瘤大小、分期和术后无疾病生存期），从而为受检者提供有效的疾病预后信息。
多组学维度HCCseek模型原理示意图
该研究对入组的76例初诊的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者和247例健康受试者进行了一项名为HCCseek的检测。HCCseek通过抽取受检者10毫升外周血，通过cfDNA sWGS绘制基因组全景地貌，并锁定两大癌症基因组地貌特征：基因拷贝数畸变（copy number aberration, CNA）和游离DNA片段大小（fragment size, FS）图谱，同时结合肝癌传统肿瘤标志物AFP检测，利用机器学习的方法判断受检者是否患癌，并计算出受检者罹患肝癌的概率值（probability of having HCC, PHCC）。
◉ 肝癌传统肿瘤标志物AFP在研究人群中的灵敏度差强人意
甲胎蛋白（alpha- fetoprotein, AFP）是被临床广为应用的一项肝癌肿瘤标志物，但是AFP能否被应用于肝癌的早筛仍然是一个颇具争议的话题。该研究发现，AFP在临床常用的阈值（20.0μg/L）下，在本研究人群中的表现为：灵敏度57.9%，特异度99.6%，表明其特异度优异，然而灵敏度不足。
◉ cfDNA全基因组CNA与肿瘤组织CNA图谱的一致性分析
CNA通常指基因组1KB以上的DNA片段发生缺失、扩增，或染色体数目改变。CNA是恶性肿瘤最基本的特征，几乎所有的肿瘤都存在不同程度的CNA。研究者通过分析一例能够同时提供外周血和肿瘤组织样本的HCC患者发现，该患者的cfDNA全基因组CNA图谱与其肿瘤组织CNA图谱有着较好的一致性，例如，肿瘤组织中呈现的chr 1q, 4p, 8q拷贝数扩增与chr 1p,4q拷贝数缺失都在cfDNA的CNA图谱中得以呈现。
同时，研究者也发现cfDNA的CNA图谱的振幅比组织弱，反映了肿瘤组织的纯度与入血DNA中肿瘤组织DNA的比例。接着，通过对76例HCC患者的cfDNA CNA结果进行GISTIC分析，研究者发现了3个显著性CNA区域：chr 1p拷贝数缺失和chr1q,12q拷贝数扩增。一些与HCC相关的致癌基因（MDM4,ELK4, PARP1 ）位于Chr 1q；而与HCC相关的抑癌基因ARID1A位于Chr 1p，与GISTIC结果有很好的对应关系。最后，研究者发现，HCC患者发生CNA的区域（bins）数目显著性高于健康受试者。
◉ cfDNA片段化模式的探索
多项研究表明，正常的cfDNA片段大小分布通常有一个167bp的峰值，而血液中来自于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA,ctDNA) 片段短于正常的cfDNA。我们通过两端测序可以评估cfDNA片段大小。同时cfDNA在基因组中的片段化模式在正常人和癌症患者中有着明显的差异， 在不同组织来源的癌症细胞中其模式也存在着差别。
近年来，不少研究发现，cfDNA片段化模式其实反映了基因组DNA与核小体和转录调控因子结合的印迹，受到核小体或转录因子保护的基因组区域片段能够较好地在血液中保留下来，而没有得到保护的片段则容易降解。因此，cfDNA片段化模式也能提供其来源细胞的表观遗传学特征。而大量研究表明，癌细胞表观遗传学特征与正常细胞有着显著差异。
基因组DNA与核小体结合示意图
在本研究中，HCC患者cfDNA有短于167bp的分布，且ctDNA丰度在90-150 bp明显提高，并伴随以10 bp为间隔的周期性振荡。接着，研究者对该细节进行深入分析，发现HCC患者的cfDNA在81，92，102，112，122 和133 bp大小的片段比例比正常人显著性增高。因此，研究者决定用P150（小于150 bp的片段占比）来衡量HCC与健康人群的差异，发现前者cfDNA中小于150 bp的片段比例比后者显著性增高。
◉ 基因组分类器（CNA+FS）能够进一步检出44%AFP阴性的HCC患者
研究者通过将CNA和FS两个维度的特征进行整合并通过机器学习建立一个基因组分类器（CNA+FS），来探索基因组分类器能否在AFP阴性的HCC患者中进一步检出存在基因组层面异常的个体。在特异性98.0%的前提下，该分类器能够进一步检出44%AFP阴性的HCC患者。
◉ 同时结合CNA，FS和AFP结果，HCCseek表现出最优的检出效能
不同维度的癌症分子特征通常能够反映不同的癌症生物学进程。研究者决定将两个基因组特征与AFP表达量相结合，通过机器学习建立HCCseek模型。在特异度98.0%的前提下，与AFP和CNA+FS相比，该模型表现出最优的总体灵敏度（75.0%），其对I期患者的检出灵敏度达58.6%。其曲线下面积(area under the curve, AUC）达0.954。
◉ 受检者罹患肝癌的概率值（PHCC）能够提示术后复发风险
该研究对51位计划接受根治性手术的HCC患者进行持续性随访，并成功随访到47位患者（中位随访时间217天）。其中，24位患者术后出现了复发，23位患者术后未出现复发。研究者根据特异度98.0%所对应的PHCC阈值（0.43）将47位患者分为高PHCC分值（>0.43）和低PHCC分值（≤0.43）。通过Kaplan-Meier曲线分析两组患者的无复发生存期概率（recurrence-free survival probability），发现高PHCC分值的患者的中位无复发生存期显著性短于低PHCC分值的患者（301天 vs 918天，p=0.032）。同时，24位出现复发患者的PHCC分值显著性高于23位没有出现复发PHCC分值。该结果说明HCCseek检测能够通过PHCC分值提示患者术后发生复发的风险。
◉ 总结
①传统肝癌肿瘤标志物AFP在本研究人群的灵敏度为57.9%，特异度为99.6%；
②cfDNA sWGS分析发现CNA和FS图谱在HCC患者和正常人有着显著差异；
③CNA+FS能够进一步筛出近一半被AFP检测漏检的AFP呈阴性的HCC患者；
④HCCseek综合CNA+FS+AFP的结果，达到了最优的检出率：特异度98.0%的前提下，总体灵敏度为75.0%，准确度为92.6%，AUC为0.954，在I期HCC的灵敏度为58.6%；
⑤HCCseek所计算的PHCC分值不仅能预测受检者患癌风险，还能提示患者疾病严重程度（包括肿瘤大小、分期和术后无疾病生存期），从而为受检者提供有效的疾病预后信息；
⑥本研究提供了一种无创、高性价比，且比传统筛查方法更为准确的多组学多维度HCC筛查方法；该方法将为普通风险人群提供一种泛癌种筛查的新思路。
Meng, Z. et al. Non-invasive detection of hepatocellular carcinoma with circulating tumor DNA features and Alpha-fetoprotein. The Journal of Molecular Diagnostics, article in press (2021). DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2021.06.003
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思勤医疗创始人茅矛博士曾任华大基因首席科学官，药明康德资深副总裁，亚洲癌症研究组织总裁；并曾在辉瑞、默沙东等国际知名药企负责癌症基因组学和分子诊断。销售负责人曾在法国施维雅、美国辉瑞及瑞士罗氏等知名药企肿瘤治疗领域积累了10多年中高层工作经验，作为最早一批进入癌症早筛领域的专业销售管理人员，在基因检测和癌症早筛领域拥有多年的实践经验与渠道资源，能够快速助力产品商业化。
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思勤医疗由知名投资机构松禾投资。公司成立三年，年收入达数千万元，已组建和发展了出色的研发、产品、市场、商务团队，具备第三方临检所资质，具备大样本量交付能力。被誉为中国最值得期待的pan-cancer早筛公司，获中国创新创业大赛优秀企业奖。
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