快讯|翱锐生物&西京医院、唐都医院联合推出肝癌早筛液体活检研究新成果

2021-07-19
早筛网讯：近日，翱锐生物与西京医院、唐都医院合作，通过低深度全基因组测序（WGS）分析乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞肝癌（HCC）患者和非肿瘤慢性肝病对照血浆样本中游离DNA（cfDNA）的拷贝数改变（CNAs）、片段大小和偏好性末端，旨在探索肝癌cfDNA的CNV标记物和片段化组学特征，为多维度肝癌早筛提供潜在理论基础，该研究发表于Molecular Oncology (IF: 6.570), 题为“Characterization of fragment sizes, copy number aberrations and 4-mer end motifs in cell-free DNA of hepatocellular carcinoma for enhanced liquid biopsy-based cancer detection”。


研究背景


目前基于液体活检的肝癌筛检的检测手段有多种，比如甲基化水平、突变检测、拷贝数变异（CNV）、核小体模式、蛋白标志物等。翱锐生物通过自主研发基于大数据人工智能分析的双层机器学习核心算法，致力于精准捕获肿瘤发生早期产生的循环肿瘤DNA（ctDNA）中所包含的重要基因的甲基化状态、基因组甲基化水平和CNV等，开发精准的癌症早期诊断。近几年，cfDNA片段化组学（cfDNA fragmentomics），也被称为cfDNA片段的特征或模式，包括片段大小、末端基序和核小体印迹等方面，是癌症诊断的一个新兴领域。然而，cfDNA片段化组学特征在早期癌症，尤其是肝癌中研究很少。因此，全面了解与肝癌发生发展相关的重要cfDNA片段长度和末端的短核苷酸基序等分子标志物，能多角度地探索癌症早期发生信号，为早筛技术的日益精准提供重要基础。

研究结果


1）cfDNA全基因组CNV图谱分析
CNV是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段拷贝数的增加或减少，主要表现为亚显微水平的缺失或重复。CNV是癌症发生的一种重要机制。研究者们分析了63例HBV-HCC肿瘤纯度（TF）>0和187例HBV患者外周血cfDNA的CNV图谱。研究发现1号染色体短臂（chr1p）、4号染色体长臂（chr4q）和8号染色体短臂（chr8p）区域的拷贝数缺失，以及1号和8号染色体长臂（chr1q、chr8q）区域的拷贝数扩增是HBV-HCC样本中比较典型的CNVs标记物 (图1)，患者有这五种CNVs中至少一种的肝癌阳性检出率高达93.7%。这些基于cfDNA的CNV图谱与前人肝癌的组织CNV图谱结果非常一致（Kan Z, et al, Genome Res, 2013,23:1422-33），表明基于液体活检的CNV检测具有前景。同时，研究发现有两例HBV非肿瘤对照基线cfDNA样本也表现出类似HCC患者的chr1q和chr8q的拷贝数扩增，这两名受试者分别在随访3个月和6个月时被确诊为HCC。这些结果提示CNV标记物不仅能够有效地区分HBV-HCC和HBV样本，而且能够在临床诊断前提示患癌风险。


2）肿瘤cfDNA片段大小分布和富集片段筛选
多项研究报道cfDNA的片段是非随机的，癌症患者的cfDNA有其特有的特征。研究者分析了20例HBV-HCC患者TF>0.2和187例HBV患者外周血cfDNA的片段大小分布图。结果发现HBV-HCC和HBV患者样本的cfDNA片段大小在167bp处均有明显的峰值，这个长度与单个核小体的DNA长度上非常接近，提示与核小体的断裂有关。同时，研究人员发现HBV-HCC和HBV样本间的cfDNA片段在其它长度区域存在明显差异。与HBV样本相比，HBV-HCC样本的cfDNA片段明显更易富集在短片段(< 150 bp) (图2A)。此外，研究发现长度小于150bp的片段在TF高的HBV-HCC样本中所占比例明显高于TF低的HBV-HCC样本和HBV样本（图2B)，这一发现支持了早期结论，即小片段cfDNA在ctDNA水平高的HCC患者占比明显高。


3）通过小于150bp cfDNA片段富集提高样本肿瘤纯度和CNV信号
基于以上的发现，考虑到早期肿瘤患者释放到血液中ctDNA浓度很低，不易于早期的筛查，研究者决定通过富集< 150bp cfDNA片段，分析是否能提高样本的肿瘤纯度和CNV检测信号。与预期一致，通过<150bp的cfDNA片段选择后，HBV-HCC样本中cfDNA的平均肿瘤纯度提高了约6.5% (图3A)。同时，发现在片段大小选择前，一些无法检测到CNV信号或CNV信号比较弱的样本，在富集后，CNV信号可以容易检测到或明显增强 (图3B-3D)。结果提示，小于150 bp cfDNA片段不仅可以作为生物标志物富集癌症样本的ctDNA，而且能够结合上述发现的典型肝癌相关的CNV生物标志物，以增强HBV-HCC特异性CNV信号应用于癌症检测。


4）肝癌cfDNA片段大小和末端基序探索
研究报道肿瘤cfDNA具有特异的偏好性末端基序序列，由于其往往在特定的基因组区域剪切断裂，而肝癌cfDNA末端基序相关探索目前尚处于初步阶段。本文研究者通过分析HBV-HCC和HBV患者之间的6个代表性的cfDNA末端基序占比，发现CCCA、CCTG和CCAG末端基序为HBV-HCC偏好性末端基序 (图4A)。为阐明cfDNA片段大小与不同的偏好性末端基序是两个独立事件，本文研究者进行了特定末端序列的片段大小分布分析和相关性分析。结果发现无论是HBV-HCC还是HBV样本中，虽然6个代表性的cfDNA末端基序的片段大小分布不同且不同末端基序在<150 bp片段占比差异更明显，但分布规律在两组样本类似，提示cfDNA片段大小与特有的末端基序有关，而这种关联并非HBV-HCC所特有 (图4B)。接着，为进一步量化不同基序与片段大小的关联程度，研究者分析了<150bp cfDNA片段大小选择对256个末端基序reads比例变化的影响。结果显示，在<150bp片段选择后，在HCC和HBV-HCC样本中，有69个4-mer末端基序（如TAAA、AAAA和TTTT）的reads比例均显著提高，而70个4-mer末端基序(如CCCA、CCTG和CCAG)的reads比例均显著降低 (图4C)。这一结果可以解释为这70个末端基序的片段大小是大于前69个末端基序的片段大小。最后，研究者对70个末端基序reads在HBV-HCC和HBV样本占比>0.005的cfDNA片段进行了片段大小和末端基序的聚类分析，结果发现HBV-HCC和HBV样本的聚类图类似，聚类到短片段的末端基序和长片段末端基序在两类样本中一致，很大程度上难以区分。这些结果共同表明，在HBV-HCC和HBV中，特定的末端基序可能有固有的片段大小，作为一种普遍存在的机制，而不是HCC特有。然而需要进一步的研究分析这种耦合背后的机制，以揭示cfDNA片段化组学的精细特征，从而更有力促进肝癌以及其它癌症类型检测。


小结


研究识别了与HCC-HBV相关的有代表性的CNVs，并发现选择小于150bp的片段能更准确检测CNV信号，提高ctDNA检测HCC-HBV样本的临床应用价值。片段组学是一个新兴的应用于早期癌症检测的热点研究，血浆DNA片段大小和末端基序模式均能够选择性的预测早期癌症。该研究发现末端基序与片段大小具有很强的耦合性。这项研究增进了我们对cfDNA生物学以及肝癌末端基序和片段大小之间关联的深入了解，同时需要进一步的研究来分析这种耦合背后的机制，以揭示片段组学的精细尺度特征，从而更有力地利用这一特征检测肝癌。

原文：Characterization of fragment sizes, copy number aberrations and 4-mer end motifs in cell-free DNA of hepatocellular carcinoma for enhanced liquid biopsy-based cancer detection

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关于翱锐生物


翱锐生物成立于2016年,专注于肿瘤无创早筛和癌症精准诊断。公司依托强大的生物技术信息分析团队，采取无创液体活检技术，以新一代测序技术为平台并结合独创的基于大数据人工智能分析的双层机器分析核心算法，针对早期肝癌病人的拷贝数变异及肿瘤甲基化特征在全基因组的水平上进行分析比对，已成功研发出高灵敏度、高特异性的肝癌早筛产品-利为康。此技术路线不仅对于肝癌的早诊早筛有效，而且可以推广至包括肺癌，胃癌，肠癌，乳腺癌，卵巢癌、子宫颈癌等其他癌症。公司准确把握肿瘤精准治疗与全程管理的大趋势，通过持续的技术创新与优化，拓展肿瘤诊断全流程产品的研发，包括早期筛查，辅助诊断，用药指导，疗效评估，治疗监测，复发耐药检测、预后监测等。



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