随着精准医疗实践的不断积累，循环肿瘤DNA（ctDNA）已成为癌症检测的重要组成部分之一。ctDNA作为一种基于血液的生物标志物，在癌症早期阶段的检测和治疗方面具有巨大的潜力。
本文将探讨利用ctDNA进行癌症早期检测的几种方法，以及ctDNA检测的挑战、限制和潜在应用。
ctDNA是大约166个碱基对的DNA片段，ctDNA包含与癌症发展相关的肿瘤相关遗传学信息，因此可以用作生物标志物。
ctDNA的临床应用主要在疾病诊断和监测方面。它可用于识别感兴趣的突变和遗传异质性。ctDNA的另一个用途是通过检测突变驱动的抗性来监测治疗效果。在精准医疗中，ctDNA引入了基于患者基因和表观遗传成分的高效疾病诊断系统。
ctDNA由长度为166个碱基对的DNA片段组成，并以极低的浓度从肿瘤细胞中分离出来。这些DNA片段被包裹在单个核小体上，这种结合保护ctDNA不受血源性核酸酶的影响。这种核小体关联为ctDNA的监测创造了机会，可以通过深度测序和阅读图谱推断出核糖体的占用情况，进而评估它们的来源。由于ctDNA是cfDNA的一种类型，ctDNA检测、分析的挑战往往是样本中的cfDNA有多少来源于肿瘤（即多少是ctDNA）。目前正在使用不同的技术来检测ctDNA。由于ctDNA是碎片化的DNA，而且数量于0.01%，这使得检测具有挑战性，特别是在肿瘤生长的早期阶段。
如今已经有针对性的方法可以监测肿瘤的进展，其中追踪肿瘤特异性突变是常用手段。例如，Q-PCR、BEAMing、Safe-SeqS、CAPP-Seq和TAmSeq等不同技术被用于此类监测。这种类型的定向监测对低至0.01%的等位基因频率极为敏感。另一种策略是全基因组测序或全外显子组测序来寻找点突变或拷贝数改变（CNAs）。这种策略使我们能够找到新的变化，而且不需要来自原发肿瘤的信息。但这是相当棘手的，因为它需要高浓度的ctDNA来可靠地重建肿瘤特定的全基因组变化。目前，使用的方法包括下一代测序、数字PCR、实时PCR和质谱技术。NGS是调查罕见突变和检测原发性癌症疾病的有力工具之一。NGS技术使其能够利用ctDNA水平反映治疗效率，并找到原发性和转移性病变的突变。由于ctDNA的数量较少，这种方法的检测和分析都非常困难。它的错误率为0.1%～1%，取决于应用的平台。数字PCR（dPCR）可以在低等位基因比例下检测ctDNA的点突变。使用dPCR使得从复杂的混合物中分割和分析单个目标序列以检测罕见突变成为可能。液滴数字PCR（ddPCR）和BEAMing是两种典型的dPCR平台。基于实时PCR的方法是目前使用的另一种技术。它对野生型DNA的敏感性也达到了10-20%的等位基因频率，几乎没有假阳性结果。目前有几种基于PCR的技术，其中等位基因特异性扩增（AS-PCR）和较低变性温度下的共扩增（COLD-PCR），已被用于常规临床实践。COLD-PCR可以检测到约0.1%的单一变异，并允许富集这一数量的突变等位基因，使突变检测灵敏度提高到100倍。大多数基于PCR的方法的缺点之一是其复用能力有限，质谱技术解决了这一局限性，能够准确检测和量化低频率的ctDNA突变。表面增强拉曼光谱（SERS）和UltraSEEK是基于质谱技术的两个系统。SERS是超灵敏的方法之一，被用来在分子水平上描述组织的特征，并提供组织的特定光谱成分。同样，UltraSEEK具有很高的复用能力和不到一天的快速周转时间，而且单次分析需要的DNA输入量很低。这些优势使质谱技术成为检测和鉴定ctDNA的一项有前景的技术。随着精准医疗和个性化医疗的普及，液体活检已成为一种很有前景的检测方法。在个性化医疗中，治疗方法取决于个人的基因突变和基因表达分析，这通常需要通过侵入性手段收集癌症组织。
收集位于躯体深部的肿瘤组织是一种挑战，并且会给患者带来负担。液体活检是一种非侵入性的检测方法，通过使用不同的体液，如血液、尿液、唾液和血清作为生物标志物，解决了这一挑战。用于癌症诊断时，液体活检使用其他与癌症相关的分析物，包括循环核酸，如循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞外囊泡（EVs）、细胞外RNA（exRNA）和循环肿瘤细胞（CTCs）。ctDNA作为液体活检中的新型分析物越来越受到关注。CTC是体液中来源于实体瘤的细胞，因为提供有关癌症扩散的信息，成为血行转移和复发的关键决定因素。
液体活检中的候选分析物及其在癌症检测和预后中的可能性ctDNA作为一种生物标志物，有可能将癌症在早期检测出来。有关ctDNA浓度的量化研究表明，恶性疾病患者的ctDNA水平明显高于健康人。另一项研究则显示，在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌和胃癌中，ctDNA浓度与肿瘤体积有关，且ctDNA浓度越高，患者总生存期（OS）越短。但也有一些研究提出了相互矛盾的结果，表明浓度与总生存期或无进展生存期没有关系。从这些研究中可以想象到ctDNA用于癌症筛查和诊断的局限性，但ctDNA仍可用于监测肿瘤的进展。ctDNA在疾病诊断和监测方面有着临床应用。一些研究通过使用ctDNA成功识别了患者肿瘤中的突变。例如，PIK3CA突变有助于识别乳腺癌，准确率达95%；KRAS和EGFR等基因突变有助于识别肺癌；卵巢癌中也存在各种类型的突变，检测准确率达到97%。因此，ctDNA有可能被用来识别感兴趣的突变和遗传异质性。ctDNA的另一个用途是通过检测突变驱动的耐药性来监测治疗效果。转移性乳腺癌患者的一个常见反应是对ESR1突变的内分泌治疗具有耐药性。通过检测ctDNA，有可能实现对这种突变的早期检测，并在乳腺癌取得临床进展之前给予治疗。同样，在胃肠道间质癌中，通过粘附KIT（S821F）和PDGFRA（D842V）的突变，可以追踪患者体内对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的敏感性。这让我们有可能利用ctDNA中的连续基因分型来追踪癌症的发展。（如图）
由于肿瘤特异性突变和甲基化发生在ctDNA中，因此ctDNA在无创检测癌症方面有很好的潜力。但对于这些癌症的诊断、预测管理和治疗指导来说，准确检测特定的无细胞核酸仍然是不可能的。而且，不同癌症的生物标志物是不同的。
ctDNA没有任何统一的检测标准。传统上，检测ctDNA需要大量的血样，因为它在血液中存在的浓度很低，在检测过程中，需要对样品进行纯化。不幸的是，纯化过程中，肿瘤DNA与血浆中的正常DNA一起被稀释，这给后续分析带来了挑战：一些检测方法中由于敏感性不足而出现假阳性。用于ctDNA的技术成本很高，在临床上也有局限性。ctDNA是一个新兴的研究领域。虽然它缺乏临床有效性和实用性，但作为一种生物标志物，它已经表现出很高的分析性能。
由于重复获取组织活检存在一些众所周知的挑战，ctDNA可以成为检测癌症的有效方法。它可以帮助克服组织活检固有的肿瘤异质性，实现个性化治疗，而且它可以比影像学手段更早发现癌症。虽然ctDNA在临床应用上有一些局限性，但它可以实时检测，并且是无创的，还具有高敏感度和特异性的优势。与其他液体生物标志物（如蛋白质生物标志物）相比，ctDNA有可能提供更多更准确，更精确的患者信息。通过检测血液中的ctDNA动态，也可以实现癌症监测。利用ctDNA和ctDNA中的甲基化水平来进行诊断、预后和治疗指导，具有广阔的前景。随着更多的研究和技术的进步，ctDNA可能成为早期癌症检测的武器。但这是一个仍在发展中的研究领域，在临床上常规使用之前仍有进步的空间。参考原文：Saha, S., Araf, Y. & Promon, S.K. Circulating tumor DNA in cancer diagnosis, monitoring, and prognosis. J Egypt Natl Canc Inst 34, 8 (2022). https://doi.org/10.1186/s43046-022-00109-4
